金顺娱乐:HPV检测国外公司技术总结

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金顺娱乐:HPV检测国外公司技术总结

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简单来讲,该法采用Invader寡核苷酸和寡核苷酸探针与靶向HPV DNA序列结合,由于设计了一个重叠序列,因此这时候这两个探针与靶向HPV DNA序列形成了一个侵袭性结构。此时,裂解酶会在重复序列裂解产生许多5端片段,并进一步与通用的发夹荧光共振能量转移器(FRET) 寡核苷酸结合,形成另一个侵袭性结构。在裂解酶的作用下,荧光分子被释放,猝灭的荧光信号恢复。通过荧光信号的强弱就能判断靶向HPV DNA序列的有无。

想要说明的是,目前国内海尔施也开发了一套基于HPV E6/E7 DNA分型检测试剂,并获得了CFDA和CE的认证。

总结,目前FDA批准的用于HPV检测的平台虽然不多,但它们所采用的技术原理都不同,且全都是自动化程度非常高的产品。国内虽然是一个极其特殊的市场,但在与这些外国产品PK时,仍然在很多指标上落后于别人。返回搜狐,查看更多

由检测原理可以看出,mRNA对比DNA具有高度的敏感性和特异性,且Aptima检测技术相对于之前的方法不会发生交叉反应。

开展宫颈癌筛查可以有效降低宫颈癌的发病率和死亡率。在北美、澳大利亚及欧洲等已有完善筛查制度的国家或地区,宫颈癌的发病率和死亡率均明显下降。而在发展中国家,子宫颈癌的发病率和死亡率却没有明显改善。我国是世界上最大的发展中国家,开展大规模宫颈癌筛查对提高人类质量具有重要的推动作用。

基本原理:样本在高温、蛋白酶、SDS及裂解液的处理下,DNA释放,再由磁珠颗粒吸附捕获。在磁性板架的配合下,通过低pH缓冲液进行DNA的清洗纯化。②目标DNA序列的PCR扩增及检测。添加PCR缓冲液和DNA聚合酶,完成PCR反应体系的建立。通过β-globin DNA和目标DNA的实时扩增和荧光检测完成整个过程。β-globin DNA的检测作为内质控,对样本的采集、DNA的提取及扩增检测进行全程监控。由于本质上Cobas 4800平台是采用实时荧光定量PCR,技术本身并不复杂,但是配合其自动化平台,已经在医院的检验科、病理科、分子中心试验室及传染病研究所等广泛使用。

Cobas 4800 HPV检测技术是罗氏公司于2009年11月在欧洲市场推出的。2011年4月,美国FDA批准Cobas 4800 HPV技术用于宫颈标本的检测。罗氏作为全球顶尖的制药和诊断技术公司,其HPV DNA诊断技术依托其强大的自动化诊断平台Cobas 4800,该平台包括两个步骤:①自动化样本核酸的分离与纯化。

Hybrid Capture 2简称HC2,于1997年由Digene公司开发,是FDA 最早批准用于诊断HPV的方法,在HPV检测领域作为“金标准”。HC2-HPV-DNA的技术原理是第二代杂交捕获,本质上是采用RNA探针进行靶标捕获,利用抗体和酶进行信号放大,与现在大热的化学发光具有异曲同工之妙。利用传统的微孔板,该法可定量检测13种高危型HPV DNA (16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68)。具体原理可看下面的视频介绍。

当标本细胞溶解后,目的mRNA被释放出来并由带有磁性微粒的低聚物捕获。转录介导等温核酸扩增是针对靶序列设计一对特异性引物,其中启动子引物(Promoter primer)上具有 T7 RNA聚合酶识别的启动子序列,这一引物与靶序列结合后,在反转录酶的作用下进行反转录反应,形成 RNA/DNA杂交分子。反转录酶所具有的RNase H活性可以水解 RNA/DNA杂交分子,形成单链NDA,该单链 DNA含有T7 RNA聚合酶识别的启动子序列。然后引物 2与单链DNA结合,通过反转录合成双链DNA。T7 RNA聚合酶结合在启动子上,以DNA为模板进行转录,由一分子DNA模板可得到100-1000拷贝转录本,这些转录本又进入反应,作为转录介导等温核酸扩增的起始模板,重复上述步骤。反应完成后,可用杂交保护试验 (hybridization protection assay: HPA) 对RNA产物进行检测。

Aptima HPV最早由Gen-Probe公司研发,后来于2012年8月被Hologic收购。FDA在2011年10月28日批准用于HPV检测的全自动分子诊断检测系统,也是最早的HPV E6/E7 mRNA 检测系统。Aptima HPV所采用的技术是转录介导等温核酸扩增,具体原理如图所示。转录介导的扩增技术可以RNA为模板,利用RNA聚合酶和逆转录酶在约42 oC等温反应条件下进行扩增,产物为RNA。该技术在每一循环可产生模板的100-1000个拷贝转录本。检测HPV E6、E7 mRNA被称为第二代HPV检测技术。由于HPV E6、E7 mRNA是2个致癌蛋白翻译的模板,对其进行检测降低了传统HPV DNA检测对于一过性HPV感染的检出率,识别出真正有癌变风险的HPV感染。

简单来讲,含有靶标的HPV DNA宫颈细胞样本经过裂解处理,释放HPV DNA链段。释放的HPV DNA链段与HPV RNA探针进行鸡尾酒杂交,并进一步被相应抗体捕获到微孔板上。加入酶标二抗并与固定的杂交体结合后,被化学发光底物检出。发出的光信号在光度计上被测出相对光单位(RLU),该强度与HPV DNA的含量多少有关,并依次来定量。

BD Onclarity HPV Assay HPV检测技术由美国BD公司(Becton, Dickinson and Company)研发,是于2018年2月12日由FDA批准的最新HPV检测方法。该方法主要依托BD Viper LT系统,系统内部集成了核酸提取,扩增和检测,能自动进行样品处理、核酸提取、即时聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增检测以及结果报告,将最小化降低人为干预。所采用的技术原理主要是实时荧光定量PCR。与罗氏的产品不同,Onclarity 也是以HPV E6、E7 DNA作为靶点进行HPV检测,能一次性检测14种高危HPV(16,18,45,31,33,35,39,51,52,56,58,59,66和68)。

由原理可以看出,该法最主要特点是不需要扩增,利用酶触化学发光进行信号放大。配合凯杰公司的自动化仪器,一个检测人员在8h内可以处理患者标本达352例,包括其间自动操作3.5小时。但该法主要限制也在于RNA探针与HPV DNA靶标之间的交叉反应。

Cervista HPV由Hologic豪洛捷/美国于2009年3月12日经FDA批准。Hologic是全球著名的医疗技术公司,公司主要通过早期检测和治疗为全球女性带来更多健康和福祉,特别是在乳腺、宫颈、微创手术和骨骼健康等领域,具有一定的领先地位。Cervista HPV采用的方法是酶切信号放(英文可搜索Invader assay),该法与HC2的特点也是不需要扩增。与HC2采用化学发光进行信号放大不同,Cervista HPV由Cleavase酶特异性识别并切割目标DNA分子结构,通过识别目标DNA与信号放大两个步骤,直接检测特定核苷酸序列。